Desenvolvimento de um sistema triplex em PCR em tempo real para quantificação de DNA humano em amostras forenses

Resumo

O DNA extraído a partir de amostras forenses se encontra com frequência em estado de degradação, o que afeta a análise de maneira signifi cativa. Além disso, tais amostras são comumente contaminadas com micro-organismos, de forma que o DNA extraído poderá conter grandes quantidades de material genético não-humano, levando a um valor superestimado da concentração do DNA pelo método padrão de absorbância no UV a 260 nm. A quantifi cação por PCR em tempo real tem sido aplicada para a quantifi cação de DNA humano em amostras forenses e alguns kits para esse propósito são atualmente comercializados. Nós descrevemos o desenvolvimento de um sistema para quantifi cação de DNA humano baseado na utilização de PCR em tempo real para amplifi car de forma específi ca, e no mesmo tubo, sequências presentes nos cromossomos autossômico e Y humanos. A metodologia utiliza “quenchers” BHQ ligados covalentemente a um oligonucleotídeo genérico (antiprimer), capaz de parear com os primers fl uorescentes livres de cada um dos alvos e inibir suas fl uorescências. A fl uorescência aumenta à medida que os produtos são amplifi cados, possibilitando a captação do sinal pelo equipamento. O sistema também possui um controle interno constituído por uma sequência de DNA sintético, com objetivo principal de indicar a presença de inibidores da reação no material genético extraído. Nós demonstramos que o triplex em questão é uma importante ferramenta para análises forenses, pois permite saber sobre a quantidade e a qualidade do DNA humano existente em uma dada amostra antes que o mesmo seja empregado nos onerosos sistemas de identifi cação humana, tais como análises de STRs, SNPs e DIPs.